探針法熒光定量RT-PCR試劑盒的準(zhǔn)備工作及使用方法
探針法熒光定量RT-PCR試劑盒使用支原體污染PCR檢測試劑盒，能在2到3小時(shí)內(nèi)獲得可靠的結(jié)果，是一種靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速的檢測支原體污染的方法。
探針法熒光定量RT-PCR試劑盒使用方法：
一、樣品DNA的制備
.用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒 DNA 提取試劑盒兼容。也可以選購本公司的一管式病毒 DNAout 或其升級(jí)版柱式病毒DNAout。
2.如果有 N 個(gè)樣品，則需要做 N+2 個(gè)提取，包括一個(gè)陽性對(duì)照和一個(gè)陰性對(duì)照。陽性對(duì)照是在 200μL 水中加 0μL PCR 陽性對(duì)照作為陽性對(duì)照，陰性對(duì)照是直接用 200μL 水作為陰性對(duì)照。提取結(jié)束后，*得到 200μL 模板 DNA(每個(gè)樣品)放冰上待用，溶解 DNA 沉淀的溶液不能少于 200μL，否則PCR 抑制物很可能會(huì)抑制 PCR。二、PCR(60 μL 體系)
3.樣品管：在 N+2 個(gè)PCR 管中加入下列成分：成分 N 個(gè)樣品管 陰性對(duì)照 陽性對(duì)照PCR MagicMix 3.0 各 20 μL 20 μL 20 μL PCR 引物對(duì) 各 2 μL 2 μL 2 μL 樣品 DNA 模板 各 8 μL - - 陽性對(duì)照(純化后) - 8 μL - 陰性對(duì)照(純化后) - - 8 μL電泳檢測
4.取 0-20 μL PCR 產(chǎn)物直接進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(本產(chǎn)品不需要單獨(dú)加loading buffer)，*使用 00 bp DNA Marker，如果樣品為陽性，將會(huì)得到長度為 3582 bp 的擴(kuò)增產(chǎn)物。
二、探針法熒光定量RT-PCR試劑盒的準(zhǔn)備：
待各組份融化后先瞬時(shí)離心，然后輕彈混勻。按下表在已滅菌的PCR管中配制反應(yīng)體系，每次實(shí)驗(yàn)需加一個(gè)陰性和一個(gè)陽性對(duì)照，測試反應(yīng)管可以有多個(gè)。配制過程中應(yīng)注意無菌，并注意避免操作產(chǎn)生的氣溶膠造成樣品間的交叉污染，在有風(fēng)壓的設(shè)備如超凈臺(tái)或生物安全柜中進(jìn)行操作。建議配制完畢后瞬時(shí)離心以使液體沉至管底。
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